Не осуществляется бинарным делением. Еще в 50-х годах прошлого века было установлено, что размножение осуществляется методом репродукции (в переводе с англ. reproduce - делать копию, воспроизводить), то есть путем воспроизведения нуклеиновых кислот, а также синтеза белка с последующим сбором вирионов. Данные процессы происходят в различных частях клетки так называемого хозяина (к примеру, в ядре или цитоплазме). Данный разобщенный метод репродукции вирусов называется дизъюнктивным. Именно на этом мы и остановимся подробнее в нашей статье.
Процесс репродукции
Данный процесс имеет свои особенности репродукции вирусов и отличается последовательной сменой некоторых стадий. Рассмотрим их по отдельности.
Фазы
Вирусная репродукция в клетке осуществляется в несколько фаз, которые описаны ниже:
- Первая фаза представляет собой адсорбцию вируса, о которой речь шла выше, на поверхности клетки, которая является чувствительной к этому вирусу.
- Вторая представляет собой проникновение вируса в клетки хозяина методом виропексиса.
- Третья - это некое «раздевание» вирионов, высвобождение нуклеиновой кислоты от капсида и суперкапсида. У ряда вирусов попадание нуклеиновой кислоты в клетки происходит методом слияния вирионной оболочки и клетки-хозяина. В данном случае третья и вторая фазы объединяются в единую.
Адсорбция
Под этой стадией репродукции вирусов подразумевается проникновение вирусной частицы в клетки. Адсорбция начинается на клеточной поверхности при помощи взаимодействия клеточных, а также вирусных рецепторов. В переводе с латинского слово "рецепторы" означает "принимающий". Они представляют собой специальные чувствительные образования, которые воспринимают раздражения. Рецепторы - это молекулы либо молекулярные комплексы, расположенные на поверхности клеток, а также способны распознавать химические специфические группировки, молекулы либо другие клетки, связывать их. У наиболее сложных вирионов такие рецепторы располагаются с внешней оболочки в виде шиповидного выроста или ворсинки, у простых вирионов они находятся, как правило, на поверхности капсида.
Механизм адсорбции на поверхности восприимчивой клетки основывается на взаимодействии рецепторов с так называемыми комплементарными рецепторами "хозяйской" клетки. Рецепторы вириона и клетки являются некими специфическими структурами, которые расположены на поверхности.
Аденовирусы и миксовирусы адсорбируются непосредственно на мукопротеиновых рецепторах, а арбовирусы и пикорнавирусы ― на липопротеиновых рецепторах.
У вириона миксовирусов нейраминидаза разрушает мукогфотеиновый рецептор и отщепляет N-ацетилнейраминовые кислоты от олигосахарида, который содержит в себе галактозу и галактозамин. Их взаимодействия на данном этапе обратимы, ведь на них значительно влияет температура, реакция среды и солевые компоненты. Адсорбции вириона препятствуют гепарин и сульфатированные полисахариды, несущие при этом отрицательный заряд, однако их ингибирующее воздействие снимается некоторыми поликарионами (экмолин, ДЭАЭ-декстран, протаминсулъфат), нейтрализующие отрицательный заряд от сульфатированных полисахаридов.
Попадание вириона в "хозяйскую" клетку
Путь внедрения вируса в чувствительную к нему клетку не всегда будет одним и тем же. Многие вирионы способны проникать в клетки методом пиноцитоза, что в переводе с греческого означает "пить", "выпивать". При данном методе пиноцитозная вакуоль будто бы втягивает вирион непосредственно внутрь клетки. Остальные вирионы могут проникать в клетку напрямую сквозь ее оболочку.
Контакт фермента нейраминидаза с клеточными мукопротеидами способствует попаданию вирионов в клетку среди миксовирусов. Результаты исследований последних лет доказывают, что ДНК и РНК вирионов от внешней оболочки не отделяются, т. е. вирионы проникают целиком в чувствительные клетки путем пиноцитоза или виропексиса. На настоящий момент это подтверждено в отношении вируса оспы, осповакцины, а также других вирусов, выбирающих средой обитания организм животных. Если говорить о фагах, они заражают нуклеиновой кислотой клетки. Механизм заражения основывается на том, что те вирионы, которые содержатся в вакуолях клеток, гидролизуются ферментами (липаз, протеаз), в процессе чего от оболочки фага освобождается ДНК и попадает в клетку.
Для проведения эксперимента выполнялось заражение клетки с помощью нуклеиновой кислоты, которая была выделена от некоторых вирусов, и вызывается один полный цикл репродукции вирионов. Однако в естественных условиях инфицирования при помощи такой кислоты не происходит.
Дезинтеграция
Следующий этап репродукции вирусов - дезинтеграция, которая представляет собой освобождение НК от капсида и внешней оболочки. После попадания вириона в клетки, капсид переживает некоторые изменения, приобретая чувствительность к клеточному протеазу, затем он разрушается, параллельно освобождая НК. У отдельных бактериофагов в клетки попадает свободная НК. Фитопатогенный вирус проникает через повреждение в клеточной стенке, а затем он адсорбируется на внутреннем клеточном рецепторе с одновременным высвобождением НК.
Репликация РНК и синтез вирусного белка
Следующим этапом репродукции вирусов является синтез вирусоспецифичного белка, который происходит с участием так называемых информационных РНК (у отдельных вирусов они находятся в составе вирионов, а у некоторых синтезируются только в зараженных клетках непосредственно на матрице вирионной ДНК или РНК). Происходит репликация вирусной НК.
Процесс репродукция РНК-вирусов начинается после попадания нуклеопротеидов в клетку, где формируются вирусные полисомы методом комплексирования РНК с рибосомами. После этого синтезируются и ранние белки, куда следует отнести репрессоры из клеточного метаболизма, а также РНК-полимеразы, которые транслируются с родительской молекулой РНК. В цитоплазме наиболее мелких вирусов, либо в ядре, образуется вирусная двунитчатая РНК методом комплексирования родительской плюс-цепи («+» - РНК-цепь) с опять синтезированной, а также комплементарной с ней минус-цепи («-» - РНК-цепи). Соединение данных нитей из нуклеиновой кислоты провоцирует образование лишь однонитчатой структуры РНК, которая называется репликативной формой. Синтезы вирусной РНК осуществляются репликативными комплексами, в которых принимают участие репликативная форма РНК, фермент РНК-полимеразы, полисомы.
Существует 2 вида РНК-полимераз. К таковым относятся: РНК-полимераза I, которая катализирует формирование репликативной формы непосредственно на матрице плюс-цепи, а также РНК-полимераза II, которая принимает участие в синтезе однонитчатой вирусной РНК на матрице репликативного типа. Синтез нуклеиновых кислот у мелких вирусов происходит в цитоплазме. Что касается вируса гриппа, то в ядре синтезируется внутренний белок и РНК. РНК выделяется затем из ядра и проникает в цитоплазму, в которой совместно с рибосомами начинает синтезировать вирусный белок.
После попадания вирионов в клетки, в них подавляется синтез нуклеиновой кислоты, а также клеточных белков. При репродукции на матрице в ядре синтезируется еще и-РНК, которая несет в себе информацию для синтеза белка. Механизм синтеза вирусного белка осуществляется на уровне клеточной рибосомы, а источником построения будет аминокислотный фонд. Активизация аминокислот осуществляется ферментами, при помощи и-РНК переносятся непосредственно в рибосомы (полисомы), в которых они располагаются уже в синтезированной молекуле белков.
Таким образом, в зараженных клетках синтез нуклеиновых кислот и белков вириона осуществляется в составе репликативно-транскриптивного сложного комплекса, который регулируется некой системой механизма.
Морфогенез вириона
Образование вирионов может произойти только в случае строго упорядоченного соединения структурных вирусных полипептидов, а также их НК. А это обеспечивается так называемой самосборкой молекул белка около НК.
Формирование вириона
Формирование вириона происходит с участием некоторых структурных компонентов, входящих в состав клетки. Вирусы герпеса, полиомиелита и осповакцины образуются в цитоплазме, а аденовирусы ― в ядре. Синтез вирусной РНК, а также формирование нуклеокапсида происходит непосредственно в ядре, а гемагглютинин формируется в цитоплазме. После этого нуклеокапсид перебирается из ядра в цитоплазму, в которой осуществляется образование оболочки вириона. Нуклеокапсид покрывается снаружи вирусными белками, а в состав вириона при этом включаются гемагглютинины и нейраминидазы. Именно таким образом происходит образование потомства, например, вируса гриппа.
Высвобождение вириона из "хозяйской" клетки
Из "хозяйской" клетки частицы вируса выделяются одновременно (во время разрушения клеток) либо постепенно (без каких-либо разрушений клеток).
Именно в таком виде и происходит репродукция вирусов. Вирионы высвобождаются из клеток, как правило, двумя способами.
Первый метод
Первый способ подразумевает следующее: после абсолютного созревания вирионов непосредственно внутри клетки они округляются, там образуются вакуоли, а затем разрушается и клеточная оболочка. По завершению этих процессов вирионы выходят все одновременно и полностью из клеток (пикорнавирусы). Данный способ принято называть литическим.
Второй метод
Второй способ подразумевает процесс освобождения вирионов по мере их созревания в течение 2―6 часов на цитоплазматической мембране (миксовирусы и арбовирусы). Выделению из клетки миксовирусов способствует нейраминидазы, разрушающие клеточную оболочку. Во время этого способа 75-90 % вирионов выходят спонтанно в культуральную среду, а клетки постепенно погибают.
Отношения вируса с клеткой хозяина могут складываться по-разному. Условно эти отношения можно свести к трем типам.
Продуктивная инфекция: цикл репродукции вируса в клетке хозяина завершается образованием нового, многочисленного поколения вирусов, обычно сопровождается гибелью клетки хозяина.
Абортивная инфекция имеет место, если цикл репродукции вируса в клетке хозяина внезапно прерывается. Клетка хозяина сохраняет свою жизнедеятельность.
Вирогения характеризуется интеграцией (встраиванием) вирусной нуклеиновой кислоты в геном клетки хозяина, что приводит в дальнейшем к синхронной репликации ДНК клетки и нуклеиновой кислоты вируса. Клетка хозяина продолжает жить.
Размножение вирусов осуществляется путем репродукции их в клетке хозяина. Цикл репродукции представляет собой процесс подчинения клеточных механизмов чужеродной вирусной информации.
Функционально ферменты вирусов можно подразделить на 2 группы: ферменты, способствующие проникновению вирусной нуклеиновой кислоты в клетку и выходу образовавшихся вирионов в среду, и ферменты, участвующие в процессах транскрипции и репликации вирусной нуклеиновой кислоты.
Цикл репродукции можно подразделить на отдельные стадии.
1 стадия – хемосорбция вирусов на поверхности клетки хозяина
Хемосорбция возможна лишь при условии, если клетка несет на своей поверхности чувствительные рецепторы, комплементарные рецепторам данного вируса. В клетках животных и человека функцию рецепторов для пикорно- и арбовирусов выполняют липопротеиды, для миксо- и парамиксовирусов и аденовирусов – мукопротеиды.
У простоорганизованных вирусов рецепторами являются уникальные сочетания белковых субъединиц, находящихся на поверхности капсида. У более сложноорганизованных вирусов функцию рецепторов выполняют выросты суперкапсида в виде шипов или ворсинок.
2 стадия – проникновение вируса в клетку хозяина.
Пути проникновения вирусов в клетку могут быть различны. Предполагается, что многие вирусы проникают в клетку путем пиноцитоза , иливиропексиса . При пиноцитозе в районе хемосорбции вируса клеточная мембрана образует инвагинацию и заглатывает вирус. В составе пиноцитарной вакуоли вирус попадает в цитоплазму.
Некоторые вирусы проникают в клетку за счет слияния клеточных и вирусных мембран.
Проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку происходит за счёт частичного разрушения оболочки клетки фаговым лизоцимом и сократительной реакции остатка фага.
3 стадия – депротеинизация вируса.
Процесс депротеинизации вируса предусматривает освобождение его нуклеиновой кислоты от белков капсида. Как только вирусная нуклеиновая кислота освобождается от белков капсида, наступает так называемый скрытый период – периодэклипса . Предполагается, что в период эклипса вирусная нуклеиновая кислота проходит по цитоплазме клетки в район ядра.
4 стадия – синтез компонентов вируса.
Совокупность процессов этой стадии можно подразделить на три этапа:
Первый этап – подготовительный. Он предусматривает две цели: подавить функционирование генетического аппарата клетки, прекратить синтез клеточных белков и нуклеиновых кислот, перевести белок-синтезирующий аппарат клетки под контроль генома вируса; подготовить условия для репликации нуклеиновой кислоты и синтеза белков капсида вируса.
Второй этап – репликация нуклеиновой кислоты вируса. Для двухцепочечных ДНК – геномных вирусов характерен такой же путь реализации генетической информации, как и для других живых организмов. Процессу репликации ДНК предшествует транскрипция иРНК. Информационная РНК вируса транслируется рибосомами клетки и на вирус – полисоме по матрице иРНК идет синтез ранних вирусспецифических белков.
Как только синтезировались ранние вирусспецифические белки, начинается процесс репликации ДНК вируса. Репликация двух – цепочечной ДНК вируса идет по принципу репликации ДНК клеточных организмов полуконсервативным путем.
Процесс репликации одноцепочечной ДНК начинается с синтеза ее комплементарной пары. В результате образуется двухцепочечная кольцевая родительская ДНК.
Изучение механизма репликации РНК – геномных вирусов началось с 1961., когда были открыты РНК-геномные фаги.
У РНК-геномных вирусов молекула РНК одновременно является генетическим материалом и выполняет функцию иРНК и ДНК.
В 1970 г. в составе одноклеточных РНК-вирусов был обнаружен фермент РНК-зависимая ДНК-полимераза, свидетельствующая о наличии процесса обратной транскрипции. Позднее было доказано, что у онкогенных РНК-вирусов по матрице их РНК с участием РНК-зависимой
ДНК-полимеразы, содержащейся в вирионе, траскрибируется ДНК-копия. ДНК-копия из одноцепочечной переходит в репликативную двуцепочечную форму, которая обеспечивает репликацию РНК вируса и синтез необходимых ферментов.
Третий этап – синтез белков капсид.
Этот процесс отстает во времени от процесса репликации нуклеиновой кислоты вируса и начинается, когда репликация в полном разгаре. Синтез белков капсида происходит как в ядре, так и в цитоплазме клетки. Вирусспецифическая иРНК транслируется рибосомами клетки, и на вирус-полисоме идет синтез белков-предшественников. Из этого «фонда» белков-предшественников и формируются белки капсида вируса.
5 стадия – сборка вирионов, или морфогенез вируса.
У простоорганизованных вирусов белковые субъединицы капсида в строго упорядоченном соединении располагаются вокруг нуклеиновой кислоты. У сложноорганизованных вирусов в процессе сборки вирионов принимают участие и клеточные структуры – ядерная и цитоплазматическая мембраны.
6 стадия – выход вируса из клетки.
Этот процесс у разных вирусов осуществляется по-разному. Выход ДНК-геномных фагов происходит при полном лизисе клетки фаговым лизоцимом. Сложноорганизованные вирусы человека и животных выходят из клетки с участком цитоплазмы путем почкования через цитоплазматическую мембрану и оболочку, одновременно приобретая суперкапсид. Нередко выходу вирусов из клетки способствует переваривание ее фагоцитами крови. Вирусы растений из клетки в клетку могут переходить через межклеточные соединения – плазмодесмы.
Наиболее часто цикл репродукции вируса завершается продуктивной инфекцией – образованием многочисленной популяции (100–200) полноценных вирионов, что обычно сопровождается гибелью хозяина.
Процесс репродукции вирусов условно можно разделить на 2 фазы. Первая фаза включает 3 стадии : 1) адсорбцию вируса на чувствительных клетках; 2) проникновение вируса в клетку; 3) депротеинизацию вируса. Вторая фаза включает стадии реализации вирусного генома : 1) транскрипцию, 2) трансляцию, 3) репликацию, 4) сборку, созревание вирусных частиц и 5) выход вируса из клетки.
Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. с прикрепления вируса к поверхности клетки.
Адсорбция представляет собой специфическое связывание вирионного белка (антирецептора) с комплементарной структурой клеточной поверхности — клеточным рецептором. По химической природе рецепторы, на которых фиксируются вирусы, относятся к двум группам: мукопротеидным и липопротеидным. Вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы фиксируются на мукопротеидных рецепторах. Энтеровирусы, вирусы герпеса, арбовирусы адсорбируются на липопротеидных рецепторах клетки. Адсорбция происходит лишь при наличии определённых электролитов, в частности ионов Са2+, которые нейтрализуют избыточные анионные заряды вируса и клеточной поверхности и уменьшают электростатическое отталкивание Адсорбция вирусов мало зависит от температуры Начальные процессы адсорбции носят неспецифический характер, являются результатом электростатического взаимодействия положительно и отрицательно заряженных структур на поверхности вируса и клетки, а затем наступает специфическое взаимодействие прикрепительного белка вириона со специфическими группировками на плазматической мембране клетки. Простые вирусы человека и животных содержат прикрепительные белки в составе капсида. У сложно организованных вирусов прикрепительные белки входят в состав супер-капсида. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов), либо шипов, грибоподобных структур у миксо-, ретро-, рабдо- и других вирусов. Вначале происходит единичная связь вириона с рецептором — такое прикрепление непрочное — адсорбция носит обратимый характер. Чтобы наступила необратимая адсорбция, должы появиться множественные связи между рецептором вируса и рецептором клетки, т. е. стабильное мультивалентное прикрепление. Количество специфических рецепторов на поверхности одной клетки составляет 10 4 -10 5 . Рецепторы для некоторых вирусов, например, для арбовирусов. содержатся на клетках как позвоночных, так и беспозвоночных, для других вирусов только на клетках одного или нескольких видов.
Проникновение вирусов человека и животных в клетку происходит двумя путями: 1) виропексисом (пиноцитозом); 2) слиянием вирусной суперкапсидной оболочки е клеточной мембраной. Бактериофаги имеют свой механизм проникновения, так называемый шприцевои, когда в результате сокращения белкового отростка фага нуклеиновая кислота как бы впрыскивается в клетку.
Депротеинизация вируса освобождение геиома вируса от вирусных защитных оболочек происходит либо с помощью вирусных ферментов, либо с помощью клеточных ферментов. Конечными продуктами депротеинизации являются нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, связанные с внутренним вирусным белком. Затем имеет место вторая фаза вирусной репродукции, ведущая к синтезу вирусных компонентов.
Транскрипция — переписывание информации с ДНК или РНК вируса на и-РНК по законам генетического кода.
Трансляция — процесс перевода генетической информации, содержащейся в и-РНК, на специфическую последовательность аминокислот.
Репликация — процесс синтеза молекул нуклеиновых кислот, гомологичных вирусному геному.
Реализация генетической информации у ДНК-содержащих вирусов идёт так же, как и в клетках:
ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок
РНК транскрипция и-РНК трансляция белок
У вирусов с позитивным РНК-геномом (тогавирусы, пикорнавирусы) транскрипция отсутствует:
РНК трансляция белок
У ретровирусов — уникальный путь передачи генетической информации:
РНК обратная транскрипция ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок
ДНК интегрируется с геномом клетки-хозяина (провирус).
После наработки клеткой вирусных компонентов наступает последняя стадия вирусной репродукции сборка вирусных частиц и выход вирионов из клетки. Выход вирионов из клетки осуществляется двумя путями: 1) путём «взрыва» клетки, в результате чего клетка разрушается. Этот путь присущ простым вирусам (пикорна-, рео-, папова- и аденовирусам), 2) выход из клеток путём почкования. Присущ вирусам, содержащим суперкапсид. При этом способе клетка сразу не погибает, может дать многократное вирусное потомство, пока не истощатся её ресурсы.
Методы культивирования вирусов
Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются ледуюшие живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные мбрионы; 3) лабораторные животные.
Культуры клеток
Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на 1) первичные (первично трипсинизированные), 2) полуперевиваемые (диплоидные) и 3) перевиваемые.
По происхождению они классифицируются на эмбрионштьные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу — на фибробластные, эпителиальные и др.
Первичные культуры клеток — это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.
Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток — клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.
Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом.
Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ, ПЭС, ВНК-21 — из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС — из почки морской свинки и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.
Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Нер-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH — из почки человека.
Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.
Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред — сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.
Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации.
При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.
Индикатором наличия вируса в заражённых культурах клеток может служить:
1) развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие вируса (ЦПД), которое имеет три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток — симпластов; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;
2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток;
3) положительная реакция гамагтлютинации (РГА);
4) положительная реакция гемадсорбции (РГАдс);
5) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.
6) при отсутствии ЦПД или ГА можно поставить реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.
Выделение вирусов в куриных эмбрионах.
Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста.
Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоско-пировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают куриные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом.
Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса.
Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.
III. Выделение вирусов на лабораторных животных.
Лабораторные животные могут быть использованы для выделения вирусов из инфекционного материала, когда невозможно применить более удобные системы (культуры клеток или куриные эмбрионы). Берут преимущественно новорождённых белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражают животных по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные — интрацеребрально, дерматотропные — на кожу.
Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у животных, их гибели, патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглтотинации с экстрактами из органов.
Этапы репродукции вируса
Парамиксовирусы с помощью гликопротеиновых рецепторов адсорбируются на чувствительных клетках хозяина. Проникновение вириона в клетки происходит путем рецепторного эндо-цитоза или при слиянии вирусной оболочки с цитоплазматической мембраной. Репликация вирусной РНК происходит в цитоплазме инфицированных клеток. При формировании вирионов происходит модификация отдельных участков цитоплазматической мембраны клетки-хозяина за счет встраивания в нее с наружной стороны вирусных гликопротеинов, а с внутренней - мембранного белка. К модифицированным участкам клеточной мембраны по актиновым нитям цитоскелета транспортируются вирусные нуклеокапсиды. Выход вирусных частиц осуществляется путем почкования. В цитоплазме инфицированных клеток образуются ацидофильные включения.
Антигенная структура и антигенная вариабельность
Антигенная структура вируса изучена слабо. Морфологическое сходство с вирусом кори человека дало возможность предположить аналогичность их антигенного состава. Основные антигены вируса кори -- гемагглютинин, белок F и нуклеокапсидный белок NP. AT к гемагглютинину и F-протеину проявляют цитотоксическое действие, направленное против инфицированных клеток.
Антигенная вариабельность. Вирус чумы в иммунобиологическом отношении однороден, в то же время по происхождению и некоторым биологическим особенностям его штаммы разделяют на две подгруппы: классические и вариантные. Классические штаммы высокопатогенны и проявляют строгую видовую специфичность.
Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства
Вирусная оболочка состоит из трех белков: гемагглютинина (Н), белка слияния (F) и матриксного (М). Также в серологических реакциях у вируса выявлены комплементсвязывающий, преципитирующий, нейтрализующий и гемагглютинирующие антигены. В связи с этим вирус способен нерегулярно агглютинировать эритроциты цыплёнка и морской свинки. Феномен гемагглютинации у вируса считают неспецифическим.
Считается, что рецепторами для адсорбции вируса являются сиаловые кислоты, имеющиеся на мембране макрофагов. В то же время установлено, что вирус чумы плотоядных лишен нейраминидазной активности. Поэтому связывание гемагглютинина с сиаловыми кислотами мембраны носит довольно слабый, лабильный характер, что снижает для вируса опасность "застрять" на поверхности клетки.
Особенности культивирования в различных живых системах
Первые опыты по культивированию вируса чумы плотоядных в эксплантатах ткани проводил Mitscheriich в 1938 г. Позднее его размножали в эсплантатах селезенки, мезентериальных лимфоузлов, легких и тестикул 10-14-дневных щенят. Авторы провели 19 пассажей, при этом титр вируса в эксплантатах селезенки достиг 2?104 ИД/г. Вирус чумы плотоядных активно размножается в первичных культурах клеток почки собак, хорьков, легких собак и хорьков; в первичной культуре клеток почки щенят 3-4 дневного возраста. В этих культурах на среде 199 с добавлением 20% сыворотки телят вирус образует бляшки под агаровым покрытием. В клетках HeLa и линии клеток печени человека вирус не вызывал ЦПЭ.
К вирусу чумы чувствительны и различные культуры клеток после его адаптации пассированием в них. В 1959 году впервые был выделен вирус от больных чумой собак путем культивирования в трипсинизированных кусочков легких или почек. В последующие годы он был также выделен в первичной культуре почек собаки, КРС, овцы, обезьяны, фибробластов эмбрионов кур и перепелов и др. К вирусу чувствительны и перевиваемые линии клеток Hela и Vero. При размножении некоторые штаммы вируса вызывают ЦПД, которое характеризуется зернистостью и округлением клеток с последующим разрушением монослоя и образованием многоядерных клеток и синцитий. Для выделения и поддержания в лабораторных условиях вируса используют молодых щенков. Однако значительно чувствительнее тхорзофретки. Материалами при выделении вируса в культуре клеток служат селезенка, печень, почка.
Вирус размножается в эмбрионах кур при инфицировании на хорионаллантоисную оболочку (ХАО), в аллантоисную полость и желточный мешок. Этот метод успешно используют также и для определения титра вируса на эмбрионах 8-9 -суточного возраста. Вирус титруют на ХАО. При размножении вируса у зараженных эмбрионов появляются изменения главным образом на хорион-аллантоисной оболочке в виде отечности и образования светло-серых узелков величиной с просяное зерно или тяжей светло-серого цвета.
При сравнительном изучении репродукции 3-х штаммов вируса чумы плотоядных на различных клеточных системах установлено, что у 1-го из них (шт. Рокборн) отсутствовало выраженное цитопатическое дейтвие, 2-й штамм накапливался в титре 3,5-5,0 lg ТЦДщ/wi и шт. Акбар-37 накапливался в титре 5,0-6,5 lg ТЦД50/мл (17). Штаммы, адаптированные к куриным эмбрионам, хорошо развиваются в культуре фибробластов куриных эмбрионов, перевиваемых линиях клеток HeLa ("бессмертные" клетки, не имеющие предела Хейфлика), Нер (клетки рака гортани)и др. Максимальное накопление адаптированных штаммов в культуре клеток отмечено на 8-9-й день. Вирус репродуцируется в культуре альвеолярных макрофагов легких собак. Через 2-6 дней в ней формируются характерные круглые многоядерные гигантские клетки, которые через 1-2 недель исчезают с образованием синцития. Адаптированный к клеткам Vero (клетки почки африкаской зеленой мартышки) шт. Green вируса чумы плотоядных способен образовывать бляшки в клетках Нер-2, BS-C-1 и HeLa, но не в клетках Vero и культуре клеток почки собак. Адаптированный к куриным эмбрионам или культуре клеток, вирус может размножаться во многих клеточных системах (собак, КРС, обезьян, человека). Вирус чумы плотоядных вызывает цитопатический эффект и титры его выше в роллерных культурах, чем в стационарных.
Предложен метод крупномасштабного культивирования вируса чумы плотоядных на микроносителях Gelaspker M (Lachema, Bruc) (диаметр 150-200 мкм), для чего клетки куриных эмбрионов или Vero выращивают в виде псевдосуспензионной культуры. При этом биологическое накопление вируса более чем в 10 раз превышало таковое при использовании стационарных культур.
Разработан метод дифференциации патогенных и аттенуированных штаммов вируса чумы плотоядных in vitro. МонАТ реагируют с нуклеокапсидным АГ аттенуированного шт. Onderstepoort, который культивируется в клетках Vero и не реагирует с патогенными шт. А75/17 и СН84, культивируемыми в первичных культурах клеток собак. Однако после нескольких пассажей в клетках Vero штаммы приобретали эпигон, реагирующий с монАТ, одновременно утрачивали патогенность для собак.
Шт. Д84-1 ВЧС, адаптированный к культуре фибробластов КЭ, вызывает выраженные ЦПИ в культуре клеток и незначительное бляшкообразование на ХАО. Шт. Д84-1 генетически стабилен и нейровирулентен для мышат.
Репродукция вирусов осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга: адсорбция вируса на клетке; проникновение вируса в клетку; «раздевание» вируса; биосинтез вирусных компонентов в клетке; формирование вирусов; выход вирусов из клетки.
Адсорбция . Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбируется на определенных участках клеточной мембраны - так назы-ваемых рецепторах. Клеточные рецепторы могут иметь разную химическую природу, представляя собой белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды. Число специфических рецепторов на поверхности одной клетки колеблется от 104 до 105. Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц.Проникновение в клетку. Существует два способа проникновения вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорбции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.«Раздевание». Процесс «раздевания» заключается в удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках цитоплазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае проникновения вируса путем слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной процесс проникновения вируса в клетку сочетается с первым этапом его «раздевания». Конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота вируса.Биосинтез компонентов вируса. Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства.Реализация генетической информации вируса осуществляется в соответствии с процессами транскрипции, трансляции и репликации. Формирование (сборка) вирусов. Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфически «узнавать» друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, солевых и водородных связей. Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:
1. Формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм;
2. Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала форми-руются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);
3. Формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;
4. Сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).
Выход вирусов из клетки. Различают два основных типа выхода вирусного потомства из клетки. Первый тип - взрывной - характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип - почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При таком механизме клетка может продолжительное время продуцировать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции.